腦片膜片鉗電生理工具

電壓鉗的原理∶用兩根前列直徑0.5um的電極插入細胞內，一根電極用作記錄電極以記錄跨膜電位，用另一根電極作為電流注入電極，以固定膜電位。從而實現固定膜電位的同時記錄膜電流。電位記錄電極引導的膜電位（Vm）輸入電壓鉗放大器的負輸入端，而人為控制的指令電位（Vc）輸入正輸入端，放大器的正負輸入端子等電位，向正輸入端子施加指令電位（Vc）時，經過短路負端子可使膜片等電較，即Vm=Vc，從而達到電位鉗制的目的，并可維持一定的時間。Vc的不同變化將導致Vm的變化，從而引起細胞膜上電壓依賴性離子通道的開放，通道開放引起的離子流反過來又引起Vm的變化，致使Vm≠Vc，Vc與Vm的任何差值都會導致放大器有電壓輸出，將相反極性的電流注入細胞，以使Vc=Vm，注入電流的大小與跨膜離子流相等，但方向相反。因而注入的電流被認為是標本興奮時的跨膜電流值（通道電流）。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的或多個的離子通道分子活動的技術。腦片膜片鉗電生理工具

膜片鉗技術是神經科學領域非常重要的一項技術，1976年由國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann發明，從而在活細胞上記錄到單個離子通道的電流。近半個世紀來，膜片鉗技術已經成為神經科學領域較常用也是較實用的技術之一，具有極大的精確性和靈活性，能夠揭示離子通道，單細胞突觸反應，及神經環路連接等多層次的電生理特性。做過膜片鉗的人都知道，膜片鉗的信號采集設備一般由前置放大器，放大器，模數/數模轉換器等構成，神經元電信號先通過前置放大器（headstage）初步放大，后傳輸入放大器進一步放大，再傳入模數轉換器轉化為數字信號，后被計算機采集。下圖顯示的是我們較常使用的AXON和HEKA膜片鉗的一個信號傳輸路徑。進口多通道膜片鉗電生理技術全自動膜片鉗技術采用的標本必須是懸浮細胞，像腦片這類標本無法采用。

Flip-Tip翻轉技術、將一定密度的細胞懸液灌注在玻璃電極中，下降到電極前列的單個細胞通過在電極外施加負壓可以與玻璃電極前列形成穩定的高阻封接，打破露在玻璃電極前列開口外的細胞膜就形成了全細胞記錄模式。德國Flyion公司的Flyscreen8500系統采用的就是這一技術，其通量比較高為6，即一次可同時記錄6個細胞。它的***特點是∶（1）仍然采用玻璃毛坯作為電極（2）藥物施加微量、快速。SealChip技術;完全摒棄了玻璃電極，而是采用SealChip平面電極芯片一定密度的細胞懸液灌注在芯片上面，隨機下降到芯片上約1-2μm的孔上并在自動負壓的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的細胞膜形成全細胞記錄模式。采用這一技術的美國Axon（MDS）公司的PatchXpress7000A系統是高通量全自動膜片鉗技術的典范，是離子通道藥物研發的**性工具，在國外實驗室和制藥廠***用于hERG通道藥理學的研究。其通量比較高為16，即一次可同時記錄16個細胞同時，其藥物施加微量、快速，不僅用于藥物篩選，還大量用于離子通道的基礎研究。

高阻封接問題的解決不僅改善了電流記錄性能，還隨之出現了研究通道電流的多種膜片鉗方式。根據不同的研究目的，可制成不同的膜片構型。細胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上，形成高阻封接，在細胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制，分辨測量膜電流，稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性，這種方式又稱為細胞膜上的膜片記錄。此時跨膜電位由玻管固定電位和細胞電位決定。因此，為測定膜片兩側的電位，需測定細胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動看，這種形式的膜片是極穩定的，因細胞骨架及有關代謝過程是完整的，所受的干擾小。一些學者建立了組織切片膜片鉗技術（Slicepatch），就能在哺乳動物腦片制備上做全細胞記錄。

內面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內面向外”膜片。此時膜片兩側的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位，膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監視器輸出是非反向的，則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。外面向外膜片(out-sidepatch)高阻封接形成后，繼續以負壓抽吸，膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起，斷端游離部分自行融合成脂質雙層，此時高阻封接仍然存在。而膜外側面接觸浴槽液。這種膜片形式應測膜片電阻，并消除漏電流和電容電流。整個過程要當心是否形成囊泡。如果浴槽保持地電位水平，膜電位即與玻管電位相等。如放大器是非反向的，放大器的輸出將與Im值相等。全自動膜片鉗技術的出現標志著膜片鉗技術已經發展到了一個嶄新階段。德國單電極膜片鉗參數

Neher創膜片鉗的膜電容檢測與碳纖電極電化學檢測聯合運用的技術。腦片膜片鉗電生理工具

膜片鉗技術與其它技術相結合Neher等**將膜片鉗技術與Fura2熒光測鈣技術結合，同時進行如細胞內熒光強度、細胞膜離子通道電流及細胞膜電容等多指標變化的快速交替測定，這樣便可得出同一事件過程中，多種因素各自的變化情況，進而可分析這些變化間的相互關系。Neher將可光解出鈣離子的鈣螯合物引入膜片鉗技術，進而可以定量研究鈣離子濃度與分泌率的關系及比較大分泌率等指標。他又創膜片鉗的膜電容檢測與碳纖電極電化學檢測聯合運用的技術。之后又將光電聯合檢測技術與碳纖電極電化學檢測技術首先結合起來。這種結合既能研究分泌機制，又能鑒別分泌物質，還能互相彌補各單種方法的不足。Eberwine等于1991年首先將膜片鉗技術與RT-PCR技術結合起來運用，可對形態相似而電活動不同的結果作出分子水平的解釋，從此開始了膜片鉗與分子生物學技術相結合的時代∶基因重組技術，膜通道蛋白重建技術。腦片膜片鉗電生理工具

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